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丙型肝炎病毒核心抗原检测的临床诊断价值
2011/8/8　打印

丙型肝炎是严重威胁人类健康的传染病之一，由于至今尚无预防疫苗问世，也没有特效药物治疗，因此早期诊断是防止丙型肝炎病毒(hepatitis C viral,HCV)传播的有效手段。临床上主要*实验室诊断来辅助诊断HCV感染，了解患者体内HCV复制的情况，常用的有丙型肝炎病毒抗体(HCVAb)和HCV RNA。但是，HCVAb产生有一个明显的窗口期，早期感染容易漏检，对感染恢复后样品产生误判，而且由于不同厂商的试剂包被的HCV抗原片段有所不同，导致检测结果缺乏可比性，故难以对感染后的进程及转归提供依据。PCR检测HCV RNA灵敏度高，但影响因素也多，实验室条件要求严格，且检测费用昂贵。据文献报道［1-4］，HCV核心抗原阳性样品HCV RNA阳性率为85％以上，两者同步消长，具有极高的相关性。HCV抗原检测能够缩短HCV检测窗口期，近几年对这方面的报道陆续增多，具有可行性和较广泛的应用基础。本研究采用ELISA方法检测丙型肝炎病毒抗原(HCVAg)，对其临床应用价值进行评价。

　　1  资料与方法

　　1.1  标本来源  选取2006年11～12月我院住院及门诊患者血清样本91份，其中男44份，女47份；年龄13～79岁，平均年龄47.7岁。所有病例选择均符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会指定的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准［5］，并排除合并感染其他病毒性肝炎，排除心、脑、肾、肺等器官疾病及高血压、糖尿病等。

　　1.2  标本检测

　　1.2.1  ELISA检测的简要步骤：取样本血清100 μl，加预处理液50 μl，56℃水浴30 min。酶标板每孔加入100 μl样品稀释液(包括空白，阴、阳对照孔，空白孔需加入200 μl样品稀释液)；加入100 μl阴、阳对照孔于相应孔，其余孔各加入100 μl经预处理后的待测样品；37℃水浴振荡60 min。洗板6次。每孔加200 μl酶结合物，37℃水浴30 min，再洗板。最后显色剂A、B液各100 μl，37℃水浴避光显色10 min后加50 μl终止液。反应终止10 min内，以酶标仪450 nm波长测定各孔OD值。
   
　　临界值(cut off)确定：阳性对照每孔OD值＞0.6，阴性对照孔OD值＜0.1时，测定结果有效，其临界值(cut off)为：阴性对照孔平均OD值+0.06。
   
　　结果判定：待检测样品的OD值＞临界值判定为HCV抗原阳性，＜临界值判定为HCV抗原阴性。

　　1.2.2  每份血清同时用ELISA法检测抗HCV，检测试剂由上海科华试剂公司提供。

　　1.2.3  每份血清用ABI PRISM 7000PCR仪荧光定量逆转录聚合酶反应(PCR)检测HCV RNA含量，检测试剂由广州达安基因股份有限公司提供。

　　1.2.4  每份血清用日本Olympus Au 2700全自动生化分析仪测定ALT浓度，检测试剂由第一化学药品株式会社提供。

　　1.3  统计学分析  采用SAS 8.2统计软件进行统计学处理，计数资料比较采用进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  62份HCV抗体阳性标本中抗原的检出率为22.6%；29份HCV抗体阴性标本中抗原的检出率为6.9%，见表1。两种样品检出率差异有统计学意义(χ2=6.128，P<0.05)。

　　2.2  16份抗原阳性标本中HCV RNA阳性14份，75份抗原阴性标本中有2份RNA阳性者，二者符合率是70.3%。见表2。

　　2.3  29份抗体阴性标本中检出抗原阳性2份，HCV RNA证实均为阳性。

 

表1  HCV抗体阳性和阴性标本中抗原的检出率情况（略）

　　注：与HCVAb(-)比较，P＜0.05    

　　表2  HCVAg与HCV RNA的符合率情况（略）

        3  讨论
   
　　HCV的主要特征为具有较高的发展为慢性肝炎的趋势，而且相当一部分患者可能发展为肝硬化甚至肝癌。目前具有典型临床表现的急性丙肝患者已经很少见，故实验室的早期诊断对控制HCV感染的传播具有非常重要的意义，人们一直在致力于寻找和研究灵敏度高、特异性强、操作简单、经济实用、易于推广的检测方法和检测项目。
   
　　人感染HCV后，存在一个相当长时间的病毒血症阳性，血清抗体阴性，这一段时间称为检验“窗口期”，HCV在体内复制活跃，传染性很强。采用ELISA方法检测HCV抗体(IgG)是临床最常用的手段之一，从第1代试剂到第3代试剂的进步，大大提高了HCV抗体检测试剂的灵敏度。但是，由于HCV具有高度的变异性,加上我国应用ELISA进行HCV检测的试剂盒及试剂抗原来源各异,致使HCV阳性率有较大的差别。而且，IgG抗体阳性者无法判断是否首次或再次新近感染，且效价高低并不能反映HCV感染的进程。鉴于IgM类抗体较IgG出现早,人们认为其效价高低在一定程度上可以代表急性期感染，在一定程度上也可以缩短HCV感染的“窗口期”，但是目前HCV IgM类抗体的检测方法和临床价值尚存在争议。
   
　　聚合酶链技术(PCR)应用于检测HCV RNA，也可以极大地缩短窗口期，检测HCV RNA具有高度灵敏度和特异性。但其操作要求、设备条件、工作环境均有较高的标准,其检测的结果还与引物、参数的设计、试剂浓度和Tag酶的存在及仪器质量均有很大关系。
   
　　应用ELISA法早期检测丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)可以克服抗HCV ELISA筛选的局限从而达到缩短窗口期的目的，也是降低HCV感染的有效途径之一。而且总HCV核心抗原检测也可用于监控慢性丙型肝炎患者体内病毒载量，评价抗HCV治疗效果。
   
　　本文数据显示62份HCVAb阳性血清和29份HCVAb阴性血清HCVcAg检出率差异有统计学意义(P<0.05)，提示检测HCVcAg具有一定的特异性。丙型肝炎病毒感染的患者在感染后1～4周内血清HCV RNA转阳，同时HCVAg出现，随后ALT增高和HCV抗体转阳［5］。抗-HCV抗体不同于其他抗体，它不是一种保护性抗体，临床上把它作为感染的证据，但由于免疫功能的差异，部分患者感染后出现抗-HCV较晚，特别是免疫功能低下者或免疫抑制剂治疗(经常输血的白血病)的患者可能不产生抗HCV抗体。急性期的检出率低，部分病例可出现假阴性。故通过检测HCVAg，可以缩短病毒感染窗口期，有助于筛查和早期诊断。
   
　　本文29份HCV RNA阳性血清检出HCVAg应全部阳性，但本次实验仅16个。导致HCVcAg阴性的原因可能有：(1)检测抗原反应系统不稳定，所取例数较少，存在抽样误差，导致其敏感性不高，特异性不好。(2)抗原出现早，抗体出现后与抗原结合，故检测不出抗原的存在。(3)抗体出现晚，消失也晚，故当患者处于恢复期时，抗原消失抗体仍存在。此外，HCV是一种极易发生突变的RNA病毒，由于其基因突变率高，导致丙肝的抗原变异性大。
   
　　本文16份抗原阳性标本中HCV RNA阳性14份，这一结果也进一步验证了HCV抗原检测方法的特异性，也提示抗原检出的可能性。另外，尚有2份抗原阳性样本未检测出HCV RNA，推测样本的保存条件在一定程度上影响PCR的结果，同时此方法也存在一些不足之处，其根本原因尚不明确，有望进行大量的进一步分析。
   
　　在本研究结果中，发现29份抗体阴性标本中检出抗原阳性2份，HCV RNA证实均为阳性，证明抗原检测在一定程度上可以弥补抗体检测的不足，更有效地控制HCV的传播。

本文RNA阴性患者抗原无阳性，一致性较高，但其中仍有5例可疑，可给临床提示存在HCV感染的风险。62份RNA阴性患者血清抗原阴性，抗体仍有35份阳性。经调查，这35例均为接受药物治疗患者，患者处于疾病恢复期，此时血中病毒核糖核酸水平处于低复制或无复制状态，血清中已无HCV RNA存在或病毒载量较低，定量PCR和HCVAg无法检出，但抗HCV仍未消失。
   
　　陈安心等［6］利用Ortho公司的总HCV核心抗原检测试剂和HCV RNA定量检测技术共同检测了116位接受联合治疗的患者的病毒血症情况，结果发现，在治疗前和治疗3个月后，总HCV核心抗原检测的效果在治疗早期(4周以内)要优于HCV RNA检测，在3个月后达到最佳效果。与HCV RNA检测相比，在监测治疗和预测PEG修饰的干扰素和利巴韦林联合治疗反应性上，监测血清中总HCV核心抗原水平是一种精确和可*的方法，可替代HCV RNA定量检测。
   
　　有研究表明［7］，与抗HCV相比，HCV抗原测定和HCV定量PCR都能显著将HCV窗口期平均缩短至36 d，但HCV RNA检测影响因素多，其中最重要的是防止核糖核酸酶(RNase)污染。所有器材均必须高压灭菌，且需专业人员操作，应注意实验人员手的污染，手套要完整并经常更换。该实验要求严格，成本高，价格昂贵。而HCV抗原ELISA检测具有较高的敏感性及特异性，可明显缩短HCV感染的窗口期，实验只需3 h，操作简便，成本较低，不需添加任何仪器设备就能完成，适合大规模筛查和大多数地区医院的常规检查。

【参考文献】

  　1 Nubling CM,Unger G,Chudy M,et al.Sensitivity of core HCV antigenand HCV RNA detection in the early infection phase.Transfusion,2002,42:10371045.

　　2 Widel A,Molnegren V,Pieksma F,et al.Detectionofhepatitis Ccoreantigeninserumor plasaasamar kerofhepatitis Cviraemiain theserologicalwindowphase.Transfus Med,2002,12:107113.

　　3 Sanz C,Tassies D,Costa J,et al.The first case of HCVinfection detected be fore seroconversion in blood donors tested by HCV core antigen ELISA.Lransfusion,2002,42:505506.

　　4 aperche S,Le Marrec N,Simon N,et al.A new HCV corean antigen assay based on disassociation of immune complexes:an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV infection.Transfusion tion,2003,43:958961.

　　5 中华医学会传染病学会.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19：5662.

　　6 陈安心，童爱飞.患者输血前血液传染指标检测结果分析.中华医院感染学杂志，2004.14：387389.

　　7 张贺秋.丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂的临床评价.中国医学检验杂志，2006，7：221223.

 

 
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