【摘要】目的： 研究输血传播性丙型肝炎与输血量、抗-HCV和ALT筛检献血血液、国内厂商的抗-HCV试剂盒质量的关系。方法： 抗-HCV采用ELISA检测，ALT用速率法测定，HCV-RNA用RT-PCR定性测定，相关因素的统计分析应用χ2检验和相关回归分析。结果： 输血传播性丙型肝炎发生率与输血量X呈正相关。输入异常ALT水平组血液的患者比输入正常ALT水平组血液的患者丙型肝炎感染的发生率显著增高（χ2=7.00，P<0.001)，输入经抗-HCV筛检的血液比输入未经抗-HCV筛检的血液的丙肝发生率减少79.76%，有非常显著的意义（χ2=315.06，P<0.001）。献血者ALT异常数与抗-HCV阳性两者有关联性（χ2=176.81，P<0.001），但关系很疏远（Pearson列联系数C=0.046）。国产ELISA抗-HCV试剂盒的弱阳性重复性符合率的差异无统计学意义（χ2=2.66，P>0.05），合计弱阳性重复性符合率是62.84%，不确定率是37.16%；总体阳性重复性符合率之间的差异有非常显著的统计学意义（χ2=10.02，P<0.001），合计总阳性重复性符合率是90.01%，总不确定率是9.99%。两次配对比较都证实国产ELISA抗-HCV试剂阳性检出率差异有非常显著的统计学意义（χ2=8.05，χ2=30.11，P<0.01）。结论： 随着输血量的增大，输血后丙型肝炎感染的危险性随之增大，符合Frost-Reed模型。血站的ALT检测有必要应该IFCC推荐方法，规范操作，减少误差，保证血液安全。建议血站用高质量的ELISA抗-HCV试剂，并增加HCV-Ag或HCV-RNA检测以缩短感染的“窗口期”，减少HCV病毒感染的残余风险度，保证输血安全。

【关键词】  丙型肝炎病毒（HCV） 抗HCV 输血 ALT

   输血及血液制品是丙型肝炎病毒感染的主要途径［1，2］，而且输血传播性丙型肝炎（又称输血后丙型肝炎，简称输血性丙型肝炎）在临床上不同年龄、不同性别的受血者中常有发生。理论上分析，受血者输血后是否感染丙型肝炎等输血性传染病是判断血液是否安全、检测技术是否合格的金标准。伴随临床疾病的不断发生和丙型肝炎病毒检测技术的不断进步，全面客观正确地评价输血传播性丙型肝炎与输血相关因素的关系已迫在眉睫。本研究从患者的临床资料和血液的采集和检测两方面的影响分析输血相关因素与丙型肝炎输血感染的关系。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究资料

    确定输血后丙肝的诊断标准：病例取自本地区1989年至2004年各医院临床输血患者，诊断标准参考《病毒性肝炎防治方案》［3］。① 发病前有输血史；② 受血后半年内，出现其他原因不能解释的肝功能异常及相应的临床表现；③血清学检查除外急性甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、戊型肝炎病毒（HEV）感染；④抗-CV和/或丙型肝炎病毒核糖核酸（HCV-RNA）阳性。

　　1.2  抗-HCV检测

    采用ELISA国产试剂。厂商分别为万泰、新创、科华等，用瑞士产“FAME-2420”和“STAR-8通道”两台全自动酶联免疫检测仪检测，按说明书操作。试剂均在使用期内，且低值2NCU/L的S/CO在“即刻法”室内质控范围之内。

　　1.3  HCV-RNA检测

    RNA提取采用常规胍酸-酚-氯仿法，按文献［4］操作，设空白对照及弱阳性对照。HCV-RNA检测采用RT-PCR法用逆转录和cDNA扩增“一步”法，按文献［5］合成逆转录引物和针对5′-NCR的cDNA引物，并按试剂盒说明书操作。

　　1.4  其他指标检测

    HAV、HBV、HEV标志物均采用酶联免疫吸附试验。ALT活性测定应用连续监测法，ALT试剂盒分别为德国进口GmbH公司的双试剂和上海长征的混合试剂，用Olympuse-2700全自动生化仪，按试剂盒说明书进行操作。

　　1.5  统计学处理

    应用χ2检验及相关回归分析。

　　2  结果

　　2.1  输血量与输血性丙型肝炎感染发生的关系

    随机调查1989年～1993年5年间本地区大医院2340例受血者。输血性丙型肝炎感染发病者为：受血者输血2周后ALT高于正常值2倍以上，无甲、乙肝炎病毒感染，有肝病临床表现的患者，且抗-HCV阳性和/或HCV-RNA RT-PCR阳性者。感染总数499人次。按用血量（1U=200ml）分组，输血量X（U）与输血性丙型肝炎发生率Y（%）的直线回归方程：Y=16.37+0.81X；相关系数r=0.846；相关系数检验t =7.616，P<0.001；决定系数R2=0.7161。结果表明输血性丙型肝炎发生率与输血量呈正相关，随着输血量增大，输血后丙型肝炎感染的发生率增大。

　　2.2  抗-HCV筛检献血员及血液制品与受血者丙型肝炎感染的关系

    用1989年～1993年未测抗-HCV的血液使受血者患丙型肝炎例数，与1994年～1998年已监测抗-HCV的血液使受血者患丙型肝炎例数比较。1989年～1993年未测抗-HCV时丙型肝炎通过输血的感染发生率为21.32%（499/2340），1994年～1998年监测抗-HCV后，丙型肝炎感染发生率降为4.20%（101/2403）。两者比较，χ2=315.06，P<0.001，两者的差异有显著的统计学意义。输血性丙型肝炎发生减少了79.76%（398/499），表明抗-HCV筛检献血者及血液制品对保证血液安全的意义是非常显著的。但仍有101例均为RT-PCR阳性，说明当时的抗-HCV试剂筛检血液仍不能完全避免丙型肝炎输血途径传播，见表1。表1  抗-HCV筛检献血者与受血者丙型肝炎感染的关系（略）

　　2.3  献血血液ALT水平与抗-HCV检测的关系

    统计本血液中心2002年一年内83452份献血血样配对做ALT、抗-HCV的检测资料。分析抗-HCV阳性与ALT活性异常两者关联性。结果χ2=176.81，P<0.001， Pearson列联系数C=0.046，表明ALT异常的献血者与抗-HCV阳性两者之间有关联性，但关系很不密切，见表2。表2  输血血样ALT检测与抗-HCV检测的关系（略）

　　2.4  国产ELISA抗-HCV试剂对各自的阳性血样的重复检测的符合率比较

　　2.4.1  弱阳性血样的重复实验符合率比较 

　　第1次双孔重复实验阳性的OD值小于2.5倍的CUT-OFF值的标本（弱阳性），在-20℃保存一个月后，第2次双孔重复实验，对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个厂商试剂的重复性实验结果进行统计。结果表明：对于S/CO≤2.5的弱阳性标本，三个厂商试剂的重复性实验阳性符合率的产别没有统计学意义（χ2=2.66，P>0.05）。合计弱阳性重复实验的符合率是62.84%，弱阳性血样的不确定率是37.16%，见表3。表3  S/CO≤2.5的阳性标本用不同厂商ELISA抗-HCV试剂重复实验阳性符合率（略）

　　2.4.2  全部阳性血样的重复性实验的符合性比较 

　　将OD值大于和不大于2.5倍的CUT-OFF值的阳性标本第1次和第2次重复性实验的阳性数合并为总体，分析各试剂总体阳性重复性符合率的差异。结果是χ2=10.02，P<0.001，表明三厂商试剂的阳性重复性符合率的差异有非常显著的统计学意义，总体阳性重复性符合率是90.01%，显然国产试剂的阳性总不确定率是9.99%。进一步两两比较总体阳性重复性符合率，调整检验水准α=0.0125。两次重复实验的总体阳性符合率Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个厂商分别为86.93%、93.34%、88.32%。比较结果：Ⅰ厂商试剂与Ⅱ厂商试剂两者的阳性符合率有显著性差异（P<0.0125），Ⅱ厂商试剂阳性符合率优于Ⅰ厂商试剂，Ⅱ厂商试剂与Ⅲ厂商试剂两者的阳性符合率无统计学意义（P>0.0125），见表4。表4  三厂商ELISA抗-HCV试剂阳性标本的重复性实验两两比较总体阳性符合率（略）

　　2.5  不同厂商ELISA抗-HCV试剂阳性检出率两两配对比较

    2002年1月～2002年3月ELISA抗-HCV检测，Ⅱ厂商分别与Ⅲ厂商、Ⅰ厂商试剂两两配对比较。由表5统计知χ2=8.05，P<0.01，表明Ⅲ厂商与Ⅱ厂商两者的ELISA抗-HCV试剂阳性检出率有显著性差异。由表6统计知χ2=30.11，P<0.01，表明Ⅰ厂商与Ⅱ厂商两者的ELISA抗-HCV试剂阳性检出率有显著性差异。表5  Ⅱ厂商试剂与Ⅲ厂商ELISA抗-HCV试剂阳性检出率配对（略）

　　3  讨论

    输血是临床常用的医疗方法，它也成为丙型肝炎广泛传播的直接因素。从本研究的资料分析可知，输血量越多，感染HCV的危险性越大，丙型肝炎发生率与用血量的关系基本符合传染病的Frost-Reed模式［6］。从Frost-Reed模式理论分析，丙型肝炎发病率也与献血人群的丙型肝炎携带率相关。丙型肝炎携带率较高的人群比较低的人群献同量的血给受血者，受血者丙型肝炎的发病率明显增高。由于职业有偿献血员人群的丙型肝炎携带率远高于无偿献血人群，所以大力提倡无偿献血，使用无偿献血的血液，可以减少输血后丙型肝炎的发病率，也是防止丙型肝炎广泛蔓延的有力措施。虽然输血量与丙型肝炎感染的关系用的是1993年前的资料，但是1993年后对血液抗-HCV进行检测后仍然有丙型肝炎感染者，只要病毒未被全部检出，输血量越多感染HCV的危险性越大的规律依然有效。因此，提示临床医生输血有风险，在目前情况下给患者输血治疗应遵循“宁少勿多，能不用就不用”的原则。

    长期以来，我国血站的血液病毒筛查都是使用酶免疫学方法，大部分血站是用国产ELISA试剂做两边测试。相对于输血安全的要求，酶免疫学方法的灵敏度较低，重复性也较差， 由于抗原抗体的变异、病毒感染的窗口期，使得该筛选方法存在一定程度的漏检，对输血安全构成了极大的威胁。本研究分析表明，抗-HCV筛选血液，使输血性HCV感染发生率由血液不测抗-HCV的21.32%减少到测抗-HCV的4.20%，输血性丙型肝炎发生减少了79.76%，有显著的预防输血后丙型肝炎的效果，但仍有残余风险度。本研究对国产ELISA抗-HCV试剂的实际使用情况比较分析表明，虽然各试剂厂商均称自己的试剂是第三代ELISA抗-HCV产品，但各试剂的各种重复性和特异性的符合率均达不到国际第三代试剂的99%的要求；从配对McNemar检验分析表明，国产各试剂的阳性检出率的差异有非常显著的统计学意义。虽然用国产两种或多种不同的ELISA抗-HCV试剂检测同一份标本可以减少一部分抗-HCV阳性漏检标本（同时增加了假阳性数），但由于国产的这些试剂在实际使用中灵敏度、特异性、重复性的差异很大的原因，还会有抗-HCV阳性标本不能被筛检出来。显然，用国产ELISA抗-HCV试剂即使检测两遍血液制品也还存在受血者感染HCV病毒的危险。法国的Courouce AM［7］比较了美国产的Abbort HCV EIA3.0, Ortho HCV 3.0 ELISA Test System, UBI HCV EIA 4.0，比利时产的Innotest HCV Ab，英国产的Murex anti-HCV Version，法国产的Monolisa anti-HCV-new antigens,意大利产的ETI-AB-HCVK-3共5个国家7个厂商试剂的灵敏度及特异性，结果均有假阴性的存在。谷金莲等［8］对抗-HCV试剂检测结果的可心度分析表明：国产抗-HCV EIA试剂与美国等国外抗-HCV EIA试剂都有假阳性和假阴性，出现漏检的问题，但国产试剂的问题更明显。我们的实验和临床两方面的分析也证实了这个观点。

    虽然一些国家应用高质量的抗-HCV检测试剂，但仍有输血性丙型肝炎的发生。人们认识到，进一步缩短检测的“窗口期”和应用高质量的抗-HCV检测试剂是保证输血安全和降低HCV感染的残余风险度的基本措施。缩短检测的“窗口期”的方法有HCV Ag检测和HCV-RNA核酸检测（nucleic-acid amplification technology，NAT）。据报道，HCV Core Ag可以在感染两周后被检出，与HCV-RNA的检出时间大致相同（抗-HCV需在感染的70d后才被检出），大大缩短检测的“窗口期”［9］。近年来，一些国家规定把HCV Ag检测作为献血员和血液制品检测的常规项目［10］；一些国家规定把HCV-RNA NAT用于献血员和血液制品的筛检［11，12］。1998年以来，世界卫生组织开始要求用HCV-RNA作为常规方法检测献血员和血液制品，并制定和多次修改了标准［13，14］。世界卫生组织正致力于在世界范围内（包括血站）推进应用NAT技术检测HCV，其目的是持续降低输血后HCV感染的残余风险度，进一步保证输血安全。这些国家的资料和本研究资料证明：单纯依靠抗-HCV不同试剂多次检测的方法仍有残余比例的输血性丙型肝炎发生，实践证明它不是预防输血传播性丙型肝炎的最好方法。依据近年来许多国家的研究成果，我们认为应用高质量的抗-HCV检测试剂HCV Ag检测或HCV-RNA检测两项联合检测是保证输血安全和持续降低HCV感染的残余风险度的最好措施。我国是丙型病毒性肝炎高发地区，为提高输血安全、降低输血性HCV感染的风险度，增加HCV Ag检测或HCV-RNA检测是必要的。

    本研究资料证明，ALT水平与抗-HCV有关联性，但列联系数不大，两者关系较疏远。在病毒性肝炎高发病的我国，这说明在目前抗-HCV检测代替ALT检测的可能性不大。在美国，早先的ALT活性检测是筛检献血员非甲非乙型肝炎病毒的指标，现在已把非甲非乙型肝炎病毒命名为HCV，所以美国的学者和研究机构的结论是用他们的抗-HCV试剂和/或HCV-RNA试剂筛检献血血液后，就不必要再做ALT活性测定，也就是用抗-HCV检测效果代替了ALT活性测定［15］。但有其他许多国家都明确要求献血员检测ALT。虽然还有一些问题和各种不同观点，但本文资料表明，我国目前的ELISA试剂质量和方法状况不支持抗-HCV检测的效果能代替ALT检测。

【参考文献】
1中华医学会肝病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防治指南.中华肝脏病杂志，2004，12：194～198.

2 尹建平，张红，马威，等. 丙型肝炎病毒感染的危险因素病例对照研究. 数理医药学杂志，2005，18（5）：455～457.
　　3 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学会.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19：56～62.
　　4 Chomcznski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocganate-phend-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156～159.
　　5 Li JS,Tong SP, Vitviski L, et al. Single-step nested polymerase chain reaction for detection of different genotypes of hepatitis C virus.J Med Virol,1995,45:151～155.
　　6 Bailey NT: Stochastic theory continuous infection; in Norman TJ，Bai-ley MA （eds): The mathematical theory of Epidemics. New York,Hafner,1957,pp91～108.
　　7 Courouce AM,Barin F, Botte C, et al .A comparative evaluation of the sensitivity of seven anti-hepatitis C virus screening tests. Vox Sang, 1995,69:213～216.
　　8 谷金莲，祁自柏，王尊文，等.丙型肝炎病毒抗体试剂检测结果的可信度分析.中华检验医学杂志，2005，28：580～583.
　　9 Peterson J, Green G, Iida K, et al. Detection of hepatitis C core antigen in the antibody negative 'window' phase of hepatitis C infection. Vox Sang, 2000, 78: 80～85.
　　10 Letowska M, Brojer E, Mikulska M, et al. Hepatitis C core antigen in Polish blood donors. Transfusion, 2004,44:1067～1071.
　　11 Gallarda JL, Dragon E,Blood screening by nucleic acid amplification technology: current issues, future challenges. Mol Diagn, 2000,5:11～22.
　　12 Hitzler WE, Runkel S. Routine HCV PCR screening of blood donations to identify early HCV infection in blood donors lacking antibody to HCV. Transfusion, 2001,41:333～337.
　　13 Saldanha J, Heath A, Aberham C, et al. World Health Organization collaborative study to establish a replacement WHO international stan-dard for hepatitis C virus RNA nucleic acid amplification technology assays. Vox Sang, 2005,88:202～204.
　　14 Coste J, Reesink HW, Engelfriet CP, et al. Implementation of donor f donor f donor screening for infectious agents transmitted by blood by nucleic acid technology: update to 2003.Vox Sang, 2005,88:289～303.
　　15 Review: Infectious disease testing for blood transfusions, NIH Consensus Development Panel on Infectious Disease Testing for Blood Trans-fusions. JAMA, 1995,274:1374～1379.