王丽 滕晓梅 权翠侠
(徐州市第一人民医院检验科,江苏徐州 221002)
[ 摘要] 目的:探讨丙肝抗原检测(ELISA 法)加样后改变反应温度及时间对检测结果的影响。方法:对234 例样本分别在37 ℃温育90min 及在43 ℃温育45min 的条件下检测丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-cAg)的S/ CO 值。
结果:两种温育条件对于样本阳性检出率、吸光度值、S/CO 值没有显著影响。结论:适当地提高温育温度及缩短温育对HCV-cAg 的检测结果影响不明显。这有助于缩短临床检验工作者的工作时间,尽快报告结果,提高工作效率。
[ 关键词] 丙型肝炎病毒核心抗原 酶联免疫吸附试验 温育
The affect of reaction incubation conditions for detecting Hcv-cAg by ELISA method
WANG Li, TENG Xiao-mei, QUAN Cui-xia
(Department of clinical laboratory, The first people's hospital of Xuzhou city, xuzhou, jiangsu 221002)
[Abstract]Objective :In this study, we discuss the effects of incubation temperature and incubation time on results ofhepatitis C virus core antigen in the reaction between packet-antibody and antigen by ELISA. Methods:234 samples were incubatedat 37 ° C for 90 min and 43 ℃ for 45min to the detect S / CO value of the hepatitis C virus core antigen (HCV-cAg) separately.
Results:The results suggested that there were no significant changes among the samples positive, absorbance and S / CO value under two incubation conditions . Conclusions:The appropriate increase of incubation temperature and shorter incubation time did not change the results of the HCV-cAg by ELISA. It is helpful for clinical laboratory workers to save work time and improve work efficiency.
[Key words]HCV-cAg; ELISA; Incubation
酶联免疫吸附试验( ELISA) 是目前临床上最为常用的感染性疾病血清学标志物免疫测定方法之一。但在临床实验室实际工作中, 经常存在测定结果差异很大的情况。温育是影响检测结果的最关键因素。温育时间及温度对ELISA 检测乙型肝炎血清标志物的影响已有相关报道, 而在丙肝抗原检测方面未见报道,因此我们采用加样后43 ℃温育45 分钟与原反应条件(加样后37℃温育90 分钟)进行比较,探讨加样反应条件的改变对测定结果的影响,为临床应用提供实验参考依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象
所采用的样本来自徐州市第一人民医院检验科从2013 年3 月-5 月份检验完毕之后的血清样本234 例,包括丙肝抗原阳性样本58 例,该58 例阳性样本经HCV-RNA 进行补充实验或跟踪复查进行了确认。
1.2 试验方法及试剂
1.2.1 样本检测方法 采用酶联免疫(ELISA)双抗体夹心法检测血清中丙型肝炎病毒核心抗原,所用ELISA 试剂盒为山东莱博生物技术有限公司丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒(批号为201302001)。操作过程参照试剂盒说明书,简述如下:
将234 例标本同时分别在37 ℃温育90 min 及43℃温育45min 后,加酶液37℃温育30min,加显色剂显色10min 终止反应观察结果,记录样本在不同温度下的OD 值、S/CO 值。通过对阳性检出率及精密性等指标的比较,探讨不同温育条件对检测结果的影响。
1.2.2 精密性比较检测 选取2份HCV 感染血清中HCV 核心抗原测定结果为阳性的样本A(S/CO=1.56),B(S/CO=6.4),1 份HCV 感染血清中HCV 核心抗原测定结果阴性的样本C(S/CO=0.44),按1.2.1 的操作步骤进行检测,A、B、C 各测10 孔/ 次;结果以S/CO 值表示,计算均数及CV 值。
1.3 仪器 杭州博日水浴箱(HB-100);美国伯乐酶标洗板机(BIO-RAD);瑞士奥斯邦全自动酶免分析仪(E-SIAR)。
2 结果
2.1 不同温育条件HCV 核心抗原初次测定结果实验表明,234 例样本在37 ℃温育90 min 条件下,共检出阳性样本58 例、阴性样本176 例,阳性检出率为23.87%。234 例样本在43 ℃温育45 min 条件下,共检出阳性样本53 例、阴性样本181 例,阳性检出率为21.81%。经χ2 检验,P<0.05,Kappa=0.941>0.75,表明两种温育条件并没有对样本阳性检出率造成显著影响,一致性良好。有5 例样本43 ℃温育45 min 检测为阴性而37 ℃温育90 min 为阳性,该5 例样本37℃温育90 min 检测为弱阳性(1<S/CO<1.2),而43 ℃温育45 min 检测为可疑(0.8<S/CO<0.99)。
表1 37℃温育和43 ℃温育条件下HCV 核心抗原初次测定结果S/CO 值分布表
样本温育条件 |
阴性结果
<0.8 |
可疑结果
0.8-0.99 |
弱阳性结果
1-1.2 |
强阳性结果
>1.2 |
37 ℃温育90 min |
174 |
2 |
3 |
55 |
43 ℃温育45 min |
165 |
16 |
6 |
47 |
表2 样本阳性检出率χ2 检验
样本温育条件 |
阴性结果<1 |
阳性结果>1 |
37 ℃温育90 min |
174+2=176 |
55+3=58 |
43 ℃温育45 min |
165+16=181 |
47+6=53 |
注:χ2=207.921,P<0.05,Kappa=0.941
2.2 不同温育条件下阳性样本、阴性样本下吸光度和S/CO 值对比
表3 6 例出现阴阳性判断差异S/CO 值
样本温育条件 |
样本1 |
样本2 |
样本3 |
样本4 |
样本5 |
样本6 |
37 ℃温育90 min |
1.05 |
1.17 |
1.14 |
1.09 |
1.14 |
0.91 |
43 ℃温育45 min |
0.97 |
0.93 |
0.87 |
0.94 |
0.82 |
1.12 |
对比发现,37℃温育90min 和43 ℃温育45mi 共有6 例出现阴阳性判断差异。其中有5 例样本在37℃处理时检测为阳性,43 ℃温育处理时检测为阴性。有1 例样本在37℃处理时检测为阴性,43 ℃温育处理时检测为阳性。且以上结果有差异样本均为弱阳性(1<S/CO<1.2)。对比58 例样本在37℃温育处理和43 ℃温育处理下S/CO 值可以看出37℃反应条件下有39 个样本的S/CO 值比该样本在43 ℃时样本的S/CO 高。从阳性样本S/CO 均值上看,37 ℃温育90 min 得到的均值比43 ℃温育45 min 得到的均值高0.08,高出1.12%,差异不显著。另外,实验中43℃温育45min 时阴性样本值比37 ℃值高。
表4 37℃温育和43 ℃温育条件下阳性样本、阴性样本吸光度和S/CO 值对比均值测定结果
|
阳性样本吸光度均值 |
阳性样本S/CO 均值 |
阴性样本吸光度均值 |
阴性样本S/CO 均值 |
37 ℃温育90 min |
0.599 |
4.79 |
0.0826 |
0.66 |
43 ℃温育45 min |
0.589 |
4.71 |
0.0854 |
0.76 |
实验表明,243 例样本在37 ℃温育90 min 条件下,S/CO 均值为4.79。243 例样本在43 ℃温育45 min 条件下,S/CO 均值为4.71。
2.3 方法内和方法间精密度
如下图所示,方法间离散指数CV 值均小于10%,说明以上样本测定结果可靠。
表5 方法间精密度评估结果
血清 |
方法间精密度 |
37 ℃ 90 min |
43 ℃ 45 min |
|
S/CO 均值 |
%CV |
S/CO 均值 |
%CV |
A |
1.53 |
3.98 |
1.26 |
4.94 |
B |
6.50 |
6.03 |
4.62 |
5.37 |
C |
0.45 |
9.12 |
0.50 |
9.84 |
3 讨论
ELISA 反应是抗原、抗体的结合在固相表面上发生的一系列的反应,抗原抗体结合是一个逐步平衡的过程,需要经过扩散才能达到反应的终点。因此,ELISA 反应需要一定时间的温育[1]。温育常采用的温度是43℃、37℃、室温和4℃,其中最常用的是37℃,也是大多数抗原抗体反应的适合温度[2]。在临床ELISA 法测定中,检验工作者往往要同一时间处理大量的样本并且要获得准确的检测结果,这需要大量的时间和精力。丙肝抗原检测中(ELISA)加样反应条件为37℃温育90 分钟,比较耗时。在乙型肝炎表面抗原酶免疫检验方法的国家中标准(ws/T 223-2002),提到加样后的反应条件为37 C 水浴或恒温箱保温2h 或43 C 保温1h,另根据阿仑尼乌斯方程式,提高反应温度可以缩短反应时间,在丙肝抗原检测中是否可以采用提高反应温度缩短反应时间,以提高工作效率,尽快报结果,因此我们设计本实验使样本中的抗原与包被抗体在水浴43℃下反应45min,与在37℃下反应90min 的结果作比较,研究结果表明,两种温育条件在大多数阳性样本及阴性样本其阴阳性检出率、吸光度值、S/CO 值没有显著差异,但在0.8<S/CO<1.2的样本易产生波动及差异。
根据本次研究结果,笔者认为在丙肝抗原检测在初次检测时可以采用43℃反应45min 的温育条件进行操作,另设定灰区(0.8<S/CO<1.2),对检测为灰区的样本再可按造产品说明书中的设计37℃反应90min 进行复查,按此方法既可以缩短反应时间,以提高工作效率,尽快报结果,同时对灰区样进行复查,也更以更好地保证结果的准确性。
参考文献:
[1] 李天君, 张印则. 影响E L IS A 检侧结果的因家[J]。中国输血杂志,2000,13(4):250。
[2] 王芳。浅谈温度对ELISA 检测法的影响[J]。医技杂志,2007,14(17):2366.
[3] 陈 鹄, 刘庆菊。温育温度及时间对ELISA 快速一步法检测乙型肝炎标志物的影响[J]。南华大学学报医学版,2006,34(1):138-139。
医学检验与临床 2013 年第24 卷第6 期 Medical Laboratory Science and Clinics,2013,Vol24,No.6
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