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直接抗病毒药物时代下丙型肝炎研究面临的挑战
2015/7/28 打印

钟劲,陶万银
( 中国科学院上海巴斯德研究所,上海 200025)
摘要: HCV 是全球范围内导致慢性病毒性肝炎的重要病原体之一。HCV 长期隐匿性感染可能会引发肝纤维化、肝硬化和肝癌 等晚期肝病。干扰素和利巴韦林联合用药广泛用于 HCV 感染的治疗,但这一疗法治疗效果有限,并且具有很强的副作用。HCV 小 分子直接抗病毒药物( DAA) 的出现大大提高了治疗效果,并有望最终完全取代干扰素疗法。然而慢性丙型肝炎治疗进入 DAA 时 代并不意味着丙型肝炎问题已经解决,丙型肝炎研究依然面对诸多挑战。
关键词: 丙型肝炎; 直接抗病毒药物; 综述
The challenges to hepatitis C research in era of direct antiviral agents
ZHONG Jin,TAO Wanyin.  ( Institut Pasteur of Shanghai,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200025,China)
Abstract: Hepatitis C virus ( HCV) is an important human pathogen that causes chronic viral hepatitis worldwide. HCV infection,often persistent and asymptomatic,could lead to liver fibrosis / cirrhosis and hepatocellular carcinoma.  The interferon / ribavirin therapy has been
widely used for treating chronic hepatitis C,but it is not always effective and has strong side effects. The development of small - molecule di-rect antiviral agents ( DAA) has greatly improved the curing efficiency ofchronic hepatitis C therapeutics and will likely replace theinterfer- on - based therapy in the future. However,these developments do not necessarily suggest that the problems of chronic hepatitis C have been completely solved.  The HCV research is still facing many challenges in this new DAA era.
Key words: hepatitis C; direct antiviral agents; review
HCV 是引起急 / 慢性肝炎、并导致肝硬化和肝癌等晚期肝 病的主要致病因子之一。目前全球约有 1. 85 亿 HCV 感染者, 尤其在发展中国家最为严重,东亚地区感染率为 3. 7%[1]。20 世纪 90 年代血清流行病学调查资料表明我国一般人群 HCV 抗体阳性率为 3. 2% ,为丙型肝炎高发区。2011 年新的流行病 学调查显示一般人群 HCV 抗体阳性率为 0.43%[2],但该数据 没有涵盖高感染率的特殊人群,因此我国  HCV  感染者的准确 数字仍有待进一步调查。根据中国卫计委发布的数据,过去 10 年内我国 HCV 新发报告人数每年以 15% 左右的速度增长,2012 年新增感染 20 多万例。HCV 主要经血液传播,目前没有 疫苗,加大了预防的难度。最近针对 HCV 的小分子直接抗病 毒药物( direct antiviral agents,DAA) 研发取得重要进展,目前 已有 4 种 DAA 在美国获得批准上市,更多的 DAA 在临床试验 中表现良好,可能于今后几年内获批。这些 DAA 的出现给丙 型肝炎的研究带来了一系列新的机遇与挑战。
1   HCV 及其引发的疾病
    HCV 属黄病毒科,其基因组是全长约 9600 个核苷酸的单 链正义 RNA。基因组两端具有空间结构保守的非编码区,中 间是长约 9000 个核苷酸的开放阅读框,翻译成为一个多聚蛋 白前体,由宿主和病毒自身编码的蛋白酶加工成 10 个成熟的 病毒蛋白,包括结构蛋白 core、E1 和 E2,离子通道蛋白 p7,非 结构蛋白 NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。HCV 有 7 种 主要基因型[3],不同基因型间的序列差异为 30% ~ 35% 。病 毒基因型可影响抗病毒治疗效果、发病进展和疫苗研发。我国 主要流行基因型为 1b 和 2a,近年来新增输入性基因型感染多 为 3a 和 6a 型。HCV 感染的慢性化率高达 80% ,可引发肝硬 化和原发性肝癌等终末期肝病。HCV 慢性感染还常并发肝外 损害,如冷球蛋白血症、淋巴瘤以及糖尿病等[4]。
2  丙型肝炎治疗的最新进展及其面临的挑站
   长期以来长效干扰素( PEG - IFN) α 和利巴韦林联合用药 是治疗慢性丙型肝炎的标准方案,可达到 50%   ~ 60% 持续病毒学应答( sustained virological response,SVR) 率。IFN 治疗效果受病毒基因型和宿主两方面的影响,欧美国家丙型肝炎基因1 型患 者 SVR 率 只 有 约 40% ,而 基 因 2、3 型 SVR 率 可 达 到80%。不同 HCV 基因型对 IFN 应答率差异的原因尚不完全清楚,有报道 NS5A 区域存在 IFN 敏感性决定区域 ( ISDR) 影响 IFN 应答[6],但这一报道并没有得到领域的认同。宿主方面最 引人瞩目是位于  IL - 28B 基 因 [编 码 Ⅲ 型 干 扰 素 ( IFNλ3) ]附近的多核苷酸多态性( SNP) 与 IFN 治疗效果的相 关性。全基因组关联性分析表明 rs12979860  SNP 位点为 C 的 丙型肝炎患者接受 IFN  治疗效果显著好于该位点为 T  的患者。 这也部分解释了不同人群接受  IFN  治疗效果的差异,高加索人 群接受 IFN 治疗效果好于非洲人群是由于人群中该位点是  C 的比例更高。中国人群 rs12979860  SNP 位点是 C 的比例高达 84%  ~ 95% ,因此中国丙型肝炎 患 者  IFN  治疗的疗效普遍偏 好[7 - 8]。此外,rs12979860  SNP 位点和 HCV 的自发性清除也 高度相关,HCV 感染自愈者( HCV 抗体阳性、RNA 阴性)  携带 C 等位点的比例也显著高于慢性感染者[9 - 12]。rs12979860  位 点影响  IFN  治疗效果的机制还有待进一步研究,也是当前研究 热点之一。最近有研究组报道了和丙型肝炎   IFN   治疗疗效关 联性更强的新的双核苷酸 SNP 位点 ss469415590( TT 或 ΔG) , 该位点和 rs12979860 位点高度连锁,ΔG 移码突变可以产生一 个新的开放阅读框,编码新的Ⅲ型干扰素( IFNλ4)[13]。IFNλ4 的表达是否以及如何影响丙型肝炎治疗的疗效,ss469415590 位点是否影响其他病毒的感染或治疗仍然不清楚,有待进一步 研究。与 IFN 抗病毒作用机制不同,DAA 可以直接抑制关键的 病毒酶或蛋白。抗 HCV 的小分子 DAA 主要针对 HCV 编码的NS5B RNA 聚合酶、NS3 蛋白酶和 NS5A。2011 年美国批准了 2 种针对 NS3 蛋白酶的抑制剂,Vertex 公司的 Incivek 和默克公 司的 Victrelis,与 IFN 加利巴韦林三重联合用药的治疗方案,开 创了小分子药物治疗 HCV 的先河。2013 年强生公司针对 NS3的 Olysio 和吉利德公司针对 NS5B 的 sofosbuvir 也获批上市。 此外还有 10 余种 DAA 进入临床二期或者三期测试,当前这一 领域正处于快速发展时期。未来有望将 2 种或更多的 DAA 联 合使用,完全取代 IFN 治疗 HCV[5]。也应冷静地看到,当前这一领域还有许多挑战: 对部分难 治性 HCV 患者的治疗如 HIV / HCV 合并感染、重症肝病患者等 治疗还需要摸索; DAA 的广泛使用势必会导致病毒的耐药性 突变的产生,针对不同 DAA 的耐药性研究对于丙型肝炎 DAA的个性化治疗有着重要意义。此外,现阶段 DAA 的高昂费用 也是其广泛应用一个限制因素,预计新的不依赖 IFN 的 DAA 一个疗程需要约 9 万美元[5],按此推算即便治愈我国 10% 的 HCV 感染者也需要花费高达数千亿美元,对于我国绝大多数患者和医疗系统都是一笔庞大的开支。由于遗传因素的影响, 我国丙型肝炎患者的  IFN  治疗效果明显优于欧美人群,因此很 有必要开展符合我国国情同时利于我国患者治愈的丙型肝炎 治疗方案的研究。
3   DAA 时代下丙型肝炎研究的思考
   3. 1 细胞模型的研究进展和挑战    回顾 HCV 研究历史,细胞 模型的建立极大地促进了  HCV  基础科学研究和新药开发。 HCV 常用细胞模型有假病毒模型 ( HCVpp ) 、复 制 子 模 型( Replicon) 和细胞培养 模 型 ( HCVcc)  等。其中细胞培养模型 能够在体外 模 拟 HCV 完 整 的 生 活 周 期,具有重要的研究价 值[14  - 16]。第一株  HCVcc  模型是基于一例日本爆发性肝炎患 者样本分离的 2a 基因型克隆( JFH - 1) 建立的。该病毒株具 有很高的体外复制能力,将 JFH - 1 的非结构蛋白和其他病毒 株的结构蛋白组合,构建了具有基因 1 - 7 型结构蛋白的嵌合 病毒[17 - 18]。通过引 入 JFH - 1 骨 架 中 发生的关键适应性突 变,建立了 1a、2a 和 2b 型全长感染性克隆[19 - 20],这些克隆都 是从共有序列来源的实验室毒株构建。最近笔者建立了一种 从临床病毒株直接构建  HCV  感染性克隆的新方法,成功构建 了我 国 首 例 HCV 的 感 染 性 克 隆 PR63cc,与 JFH - 1 相 比, PR63cc 对某些 DAA 敏感性存在显著差异[21],说 明 构 建 临 床 株来源的  HCV  感染性克隆对于评价  DAA  疗效具有重要意义。Huh7 及其衍生细胞系 Huh7. 5 和 Huh7.  HLCZ01,不仅能够较 好地支持细胞培养的 HBV 和 HCV 感染,还可以被临床 HCV 毒株感染[22],在研究临床病毒株耐药性等方面具有很大的应 用价值。干细胞技术的快速发展为新型感染模型提供了另外 一个发展方向,iPS   细胞经诱导转化成的肝细胞[23]或者体外直 接转化的肝细胞 (  iHep) [24 - 25] 可用于建立不同遗传背景的个 性化 HCV 细胞感染模型,用于评价宿主因素对  HCV  感染、病 理和治疗等方面的影响。
   3. 2 动物模型的研究进展和挑战HCV 感染和致病机制的 基础研究,药物和疫苗开发均依赖于合适的动物模型。人类是 目前已知唯一的   HCV   天然宿主。除了人类之外,黑猩猩也对 HCV 易感,但感染后病症较轻。此外黑猩猩数量少、繁殖慢、 使用费用高、动物福利和伦理问题复杂,极大限制了黑猩猩感 染模型应用。建立完善的丙型肝炎小动物模型一直是本领域 的重要目标,近年来也取得了一定的进展。人肝细胞嵌合小鼠 模型能支持 HCV 感染和复制,但该模型制备困难,成本高昂, 并且缺乏针对   HCV   的免疫病理反应。人肝细胞嵌合小鼠模型 中引入部分人免疫系统后得到人源化小鼠模型,该模型可以有 限支持 HCV 感染并伴随发生部分肝炎病理症状,但该模型制 备技术复杂,HCV 感染效率高[26]。
表达支持 HCV 感染的人源宿主因子的小鼠模型是另外一 种研究策略。利用转基因或者腺病毒载体在鼠肝脏表达 HCV 的受体 / 辅助受体分子 CD81 和 OCLN 后,可检测到 HCV 瞬间感 染和复 制。抑制小鼠天然免疫反应后可以检 测 到 更 持 久 的 HCV 复制,且有少量子代病毒产生[27]。如何进一步提高 HCV 在小鼠中的感染效率,在病理上更加接近人体的丙型肝炎发病 进程是本领域的重要挑战。此外,国内外学者也报道了树鼩能 被 HCV 一过性感染,但感染的重复性和稳定性还有待提高[28]。
   3. 3 疫苗的研究进展和挑战   相对于治疗上的巨大进展,HCV 疫苗的开发进程缓慢。HCV 具有多种逃避宿主免疫系统 攻击,建立持续性感染的能力,而且 HCV 变异率高,不同基因 型遗传差异性大,为广谱疫苗的开发提出了挑战[29]。缺乏合 适的小动物感染模型也阻碍了 HCV 疫苗的开发。最近 HCV 包膜蛋白 E2 核心区晶体结构已经解析[30 - 31],为中和抗体识 别 E2 和疫苗的研发提供参考依据。另外,含有基因 1 - 7 型来 源的结构蛋白的嵌合 HCV 感染性克隆的建立为广谱疫苗的研 发提供了重要的检测平台。由于 T 细胞免疫,尤其是 CD8 + T 细胞在 HCV 的免疫清除中发挥了重要作用,因此研发出可以 同时诱导有效的针对 HCV 的 B 细胞和 T 细胞免疫反应的疫苗 是本领域的重要研究目标。
   3. 4 HCV 致 病 性 研 究 同样受制于动  物研究模型的不足,HCV 致病性机制目前了解的很少。通常 HCV 的病毒清除会相 应减轻炎症、纤维化症状等,少数患者清除 HCV 后仍然持续发 生肝脏炎症反应,并继续加重发展肝纤维化。如果患者在接受 HCV 抗病毒治疗前已经发生较重纤维化,即便清除了病毒也可 能会发展成为肝癌[32]。这部分人群中患者的最终康复,仍需要 加大研究 HCV 致病机理、HCV 相关重症肝病的治疗等。
4   总结和展望
    从上世纪 80 年代末 HCV 被发现以来,随着科学研究的逐 步深入,HCV    的防控取得了令人鼓舞的进展,今后几年内将可能出现完全不依赖 IFN 的治疗方案。然而也应当清醒地看到,当前  HCV  新药几乎都是由国外公司研发的,高昂的费用让国内绝大多数患者和医疗系统都难以承受。考虑到 HCV 感染的隐匿性,开发有效的疫苗仍是预防感染的首选。由于受到市场 因素的影响,企业界对  HCV  疫苗研发的兴趣和投入不大,此任务在很大程度上需要得到政府和公共社会资源的支持。如何 立足我国国情,控制 HCV 治疗成本,提高预防、治疗效果还需
要政策制定者、广大科研人员、医务工作者及相关药物研发企业共同努力,协力配合。
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