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HCV 核心抗原测定用于丙型肝炎早期诊断
2013/7/8 打印

HCV 核心抗原测定用于丙型肝炎早期诊断临床价值的评估

 

洪 俊1 饶永彩2 李 艳1

1 武汉大学人民医院检验科 武汉 430060

2 武汉生物制品研究所 武汉 430060

 

摘要 目的:评估HCV 核心抗原ELISA 测定法用于HCV 早期诊断的临床价值。方法:采用HCV 抗体、HCcAg测定法及荧光定量PCR 1 948 份未感染HCV 阴性血样(1 500 份供血者的血样、400 份体检的血样及48 份非HCV 患者血样)进行了HCV 血清学及分子生物学检测。结果:对非HCV 感染标本测定结果表明,1 500 份血库标本中有8 份在初次HCV 核心抗原测定时出现阳性(0.53%)400 份体检血样HCV 核心抗原测定结果全阴;48 例住院非HCV 患者HCV 核心抗原检测结果只有1 例阳性(2 . 08%),上述抗原阳性血样的HCVPCR 均为阴性,特异性为99. 94%;我们96 HCV 感染的血样(55 例来自我院传染科HCV 患者病人;41 份来自9 HCV血清panel)进行了HCV 核心抗原测定及HCVRNA 测定,结果表明有91 HCV 核心抗原测定阳性,敏感性为94 .79%;9 HCV 血清panel 测定结果表明,Anti-HCV 方法相比,HCV 抗原测定及HCV 荧光定量PCR 都能显著地将HCV 窗口期平均缩短至36 ;方法内及方间精密度的CV 值均小于10%;结论:HCV 核心抗原ELISA 测定法具有与传统HCV-RT-PCR 相比的高度敏感性及特异性,可以明显的缩HCV 早期感染窗口期;它应用将会显著地降低HCV 感染。

 

关键词 肝炎病毒,丙型;核心抗原;聚合酶链反应

中图分类号 R987.7 文献标识码 A 文章编号 1671-8852(2005)01-0000-00

Clinical Value of HCV Core Antigen Enzyme Immunoassay in Early Diagnosis

 

Hong Jun,Rao Yongcai,Li Yan,et al

Dep artment o f Clinical L ab,Renmin H os p ital,W uhan U ni ve rsit y,W uhan 430060,China

 

Abstract

 

Objective:T o assess the performance of a newly developed ELISA for the detection of HCVcore antigen and its suitability for use in the screening of blood units in order to identify infectingsamples that do not contain specific antibodies . Methods:1 500 sera from blood donors,400 generalpopulation samples,48 patient samples(without HCV infection),55 HCV patient samples(HCV RNA-positive,and anti-HCV-negative),3 natural seroconversion panels,and 6 commercialseroconversion panels were tested with HCV IgG anti-body test,core antigen test and RNAPCR test C . Results:Eight (0.53%)blood donor samples,0(0%)general population samples,and 1 (2. 08%)patient samples(without HCV infection)were initially reactive;1sera sampleswas positive on repetition . These 9 samples tested by reverse transcription-PCR were negative.The specificity and sensitivity of HCV core antigen test were 99 . 94% and 94.79% . The reductionin diagnostic window period resulting from use of HCV Core antigen test and RNA PCR inthe 9 panels was equal onaverage to 36 days . The intra- and inter-assay precision of HCV coreantigen assay was less than 10% .Conclusion:The HCV core antigen assay showed high sensitivityand specificity and could obviouslyreduce the windows period of HCV .

Key Words hepatitis C virus;core antigen;polymerase chainreaction

 

临床上诊断HCV 感染主要依赖HCV 抗体测定法[1];但由于体内抗体产生周期长达数月[4];处在窗口期HCV 患者是丙型肝炎传播的重要来源[2 ,5]。虽然,PCR 等技术能有效HCV 携带者窗口期[6 ],但该技术存在着操作复杂、费用昂贵等问题[7],显然目前,PCR 不适用于HCV 普查。HCV 核心抗原是由HCV 基因组保守序列C 区部分编码而来,近年来研究表明:在丙肝患者中HCV 核心抗原的出现与HCV RNA 水平具有良好的相关性[3];因此,HCV核心抗原的测定是当前用于HCV 早期诊断比较理想方法。目前,检测HCV 核心抗原,在国内临床上实际应用还比较少,缺乏相关的应用数据;本研究目就是评估HCV 核心抗原测定用于HCV 早期诊断的特异性、敏感性以及在缩短HCV 窗口期诊断时间上的可行性及临床价值;为该方法用于临床提供实验依据。

 

1 材料与方法

 

1 .1 血清学检测方法 HCV 核心抗原测定系统采用的是美国Ortho Diagnostics 公司的HCV 核心蛋白ELISA 试剂盒[3] ,其反应原理是采用的双抗体夹心法;;具体操作方法见Ortho Diagnostics 试剂盒说明;结果判断:反应结束后用酶联免疫测定仪于492nm 波长处读取测定孔的OD ;,凡测定标本OD 值小于临界值(CO)的为阴性(CO = 0 . 04 + 3 个阴性对照孔OD 均值);OD 80%× 临界值(CO)1× 临界值(CO)之间为可凝;OD 120 %× 临界值~ 1× 临界值为弱阳性,OD 大于120 % × 临界值为强阳性。HCV 抗体(IgG)测定系统采用的是北京万泰药业公司及深圳月亮弯公司的HCV 抗体ELISA试剂盒,具体操做方法见试剂盒说明。

1 .2 分子生物学检测方法 HCV RNA 的检测采用的是瑞士Roche 公司LightCycler 荧光定量PCR仪及其相应试剂盒,其测定最大灵敏度为500 拷贝/ml,结果判断,>1× 103 为阳性, <1× 103 为阴性;

体操作见试剂合说明。

1 .3 采用质控品对HCV 抗体和RNA 测定进行质量控制(质控品均来源于卫生部临检中心的HCV质控血清)

1 .4 血样 未感染HCV 血样:2001 8 月~ 200110 月间我院血库供血样1 500 ;2002 3 月~9 月间我院的体检人群血样400 ;以及2001 9月~ 2002 11 月于我院住院的非HCV 患者血样48 ,(其中5 例为HAV 抗体阳性,20例为HBV抗原阳性,8 例为自身免疫性肝炎;4 例为HBV 抗原及HDV 抗体阳性;6 RF 因子阳性,5 例抗核抗体阳性). HCV 感染血样:55 2001 7 月~ 200210 月我院传染科住院HCV 患者(HCV RNA 定量PCR 阳性、抗HCV 阴性血样);9 HCV 血清panel(每套panel 包含从HCVRNA,anti-HCV阳性的系列血样),其中商业途径获得有6 (6227,6225,9041 购自bioclinical Partners;PHV903,904,919 购自Boston Biomedica;),自已收集3 (N01N02N03;采集自我院HCV 患者)

1 .5 实验的设计及结果的分析

1 .5 .1 特异性评估 为评估HCV 核心抗原测定方法的特异性,我们对1 948 份未感染HCV 阴性血样(1 500 份血库供血者的血样、400 份我院体检的血样及48 份非HCV 患者血样)进行了HCV 血清学及分子生物学检测;首先采用两种ELISA 方法对HCV 抗体进行了测定,所有标本全部阴性;然后将上述标本全部进行HCV 核心抗原测定,凡初次阳性的标本再复查一次;并用定量PCR 进行确证。

1 .5 .2 敏感性及HCV 早期诊断应用价值评估我们应用HCV 核心抗原测定方法及HCV 荧光定量PCR 55 例我院传染科住院病人(HCV 定量PCR 阳性、抗HCV 阴性血样)9 HCV 血清panel 进行了测定。

1 .5 .3 核心抗原方法内及方法间精密度评估

1.5 .3 .1 方法内精密度评估 选取HCV 感染血清中HCV 核心抗原测定结果强阳性的标本A(S/CO = 1 .8),进行HCV 抗原检测,10 / ;结果以S/ CO 值表示,计算其均数及CV 值。

1.5 .3 .2 方法间精密度评估 选取两份HCV 感染血清中HCV 核心抗原测定结果强阳性的标本A(与方法内精密度测定使用的血清相同),B(B 血清为重新选取的HCV 核心抗原强反应血样S / CO =3);对上述血清分别进行5 HCV 抗原重复检测,2 / 每次;上述结果以S/ CO 值表示,并计算其均数及CV .

1 .6 统计学方法采用SAS 分析软件计算均数和CV ,并参考特异性和敏感性公式计算特异性和敏感性,P <0 .05 为有统计学差异。

 

2 结果

 

2 .1 特异性 1、表2 表明1 500 份血库标本中有8 份在初次HCV 核心抗原测定时出现阳性(0 .53%)其中弱阳性标本3 ;S/ CO 值的分布表明;1 500 份血样中有1492 HCV 核心抗原阴性,S /CO 值小于0 . 5 1 467 (98 .32%);S/ CO 值在0.5 0 .79 之间的有21 (1.4%),S / CO 值在0.8 0 .99 的有4 (0.27%),8 例初次阳性反应的标本进行HCV 核心抗原复查,结果表明有1 例阳性(0 .07%),HCV RT-PCR 对上述8 例标本进行确证,结果全为阴性. 400 份体检血样HCV 核心抗原测定结果全阴,S / CO 值均小于0 . 5;HCV RTPCR均为阴性;48 例住院非HCV 患者HCV 核心抗原检测结果只有1 例阳性(2 .08%),该标本复查后S / CO 小于0 .5;HCV RT-PCR 确证结果为阴性。

 

1 特异性评估中的HCV 核心抗原测定结果(%)

 

样本

H CV 核心抗原初次

检阳性查结果

复查阳

性结果

HCV RT-PCR

  阳性结果

血库血样(1 500 )

8(0 .53%)

1(0 .07%)

0

  体检血样(400)

0

0

0

  住院病人血样(48)

1(2 .08%)

0

0

 

2 特异性评估中的HCV 核心抗原初次测定结果S /CO 值分布表(%)

 

样本

H CV 核心抗原初次检阴性查果

可疑结果

弱阳性结果

强阳性结果

<0 .5

0 .50 .79

0 .80 .99

11 .2

>1 .2

血库血样(1500 )

1467(98 .32%)

21(1 .4 %)

4(0 .27%)

3(0 .2%)

5(0 .33 %)

体检血样(400)

400(100 %)

0

0

0

0

住院病人血样(48)

47(97 .92%)

0

0

1(2 .08%)

0

2 . 2 敏感性 55 例我院传染科HCV 患者血样(HCV 定量PCR 阳性HCV 阴性血样)HCV 核心抗原测定结果中,52 例出现阳性(94 .55%),S /CO 值均大于1. 2;3 (P01P02P03)出现阴性,其中有一例结果在可疑范围内(具体结果见表3),复查后S / CO 值小于0 .5;

3 55 例传染科HCV 患者血样中3 HCV 核心抗原检测结果阴性样本的S /CO 值及HCVRNA 拷贝数

样本

S / CO

RNA(拷贝/ ml)

P01

0 .27

0 .1× 103

P02

0 .12

ND(ND = 未检测到)

P03

0 .87

0 .9× 103

HCV 血清panel HCV-核心抗原,HCV-RNA 及抗HCV 抗体测定结果表明(见表4);9 套血清中有7 HCV 血清panel HCV-核心抗原,HCV-RNA 初次出现阳性结果时间完全一致;2 套不一致,编号N03 血清panelHCV RNA 血清初次阳性结果时间比HCV-核心抗原结果提前3 d,编号6227 商业血清panel HCV RNA 血清初次阳性结果时间比HCV-核心抗原结果提前1 d. 应用HCV-核心抗原与HCV-RNA测定分别使HCV 窗口期缩短的平均时间分别是35 .8(21 78)d 36 .6(22 78)d;上述9 套血清panel 中总共有41 HCVRNA 阳性,HCV 抗体阴性血清,其中39 HCV 核心抗原测定阳性(95 .12%)

4 HCV-核心抗原HCV-RNAANTI-HCV 检测在缩短HCV 窗口期的时间对比表

 

血清panel

采用以下方法检测结果初次阳性的时间(Days)

核心抗原测定使HCV 窗口期缩短的时间(Days)

荧光定量PCR 使H CV 窗口期缩短的时间(Days)

H CV 核心抗原测定 HCV 荧光定量PCR  Anti-HCV-test

No1

0

0

34

34

34

N02

35

35

67

32

32

N03

56

53

88

32

35

6227

17

16

38

21

22

6225

13

13

47

34

34

9041

23

23

62

39

39

PH V903

73

73

105

32

32

PH V904

3

0

23

20

23

PH V919

18

18

96

78

78

 

2 .4 方法内及方间精密度 如表5 所示方法内及方法间离散指数CV 值均小于10%

 5 方法内及方间精密度评结果

 

血清

方法内精密度

方法间精密度

S / CO 均值及范围             % CV

S/ CO 均值及范围               % CV

A

1 .83(1 .472 .01)

  9 .1

2.15(1 .842 .31)

9 .9

B

 

 

2.98(2 .753 .49)

9 .3

 

3 讨论

 

  20 世纪90 年代以来,临床上诊断HCV 感染主要利用基因工程表达HCV 抗原构成的ELISA 法来测定抗HCV 抗体;但由于HCV 感染患者体内抗HCV 抗体的产生需一定的时间周期,此时间在普通人最长可至2 个月,免疫缺陷患者则可高达12 个月[4],此间,HCV 病毒可大量存在于病毒携带者的外周血中而不被查觉,因此,处在窗口期的HCV 患者是目前输血性肝炎传播的一个重要来源[5 ]。虽然,一些分子生物学技术如RT-PCRbDNA-PCR能有效地将HCV 携带者的窗口期缩短至15 20d[6],然而上述技术存在着操作复杂、对人员及设备要求高及费用昂贵等问题[7],在现阶段,PCR 不适用于HCV 普查,因此,当前急需一种,简单快捷、费用低、具有高度敏感及特异性的方法用于HCV 抗体阴性的血源筛查。

HCV 核心抗原测定是近年来国际上出现的一种新的测定方法,国外的研资料表明它与HCVRNA存在着很好的相关性,可用于HCV 早期诊断[3],但国内对于该法的应用还处于初始阶段,缺乏持这种方大规模应用的较为完整临床实验数据还比较,因此,在国内对该法的临床应用价值作了全面考查. 以为临床应用提供完整的实验依据。

特异性,1 948(1 500 + 400 + 48)例非HCV感染的血样的测定表明,在非HCV 标本中有1 946HCV 核心抗原结果阴性(99 . 94%),9 份的血样出现阳性(0 .46%),特异性为99. 94%;完全达到目前公认的一些用于筛查输血感染疾病ELISA方法的要求[8 ,9 ];9 份血HCV 核心抗原阳性的血样进行HCV 核心抗原复查及HCV 荧光定量PCR测定,结果HCV 核心抗原复查仍有1 份血样为阳性;HCV 荧光定量PCR 结果均为阴性;分析原因可能是HCV 核心抗原测定假阳性,PCR 的假阴性所致(血样中HCVRNA 低于500 拷贝);此外,在核心抗原方法测定阴性的结果中有1 914 (98 .35%)血样S / CO 小于0 . 5,仅有4 (2.05%)结果出现可疑范围;显示出良好的结果判别能力。

在敏感性,我们对96 HCV 感染的血样(HCV 定量PCR 阳性、抗HCV 抗体阴性,55 例来自我院传染科HCV 患者病人;41 份来自9 HCV血清panel)进行了HCV 核心抗原测定及HCVRNA测定,结果表明有91 HCV 核心抗原测定阳性,敏感性为94.79%,1 份结果可凝(1.04%);9HCV 血清panel 测定,结果表明,与抗HCV 抗体方法相比,HCV 抗原测定及HCV 荧光定量PCR 都能显著地将HCV 窗口期平均缩短至36 d(HCV 核心抗原测定:35 .8 d;HCV-RT-PCR:36.6 d);本研究结果显示HCV-核心抗原ELISA 方法的敏感性达到PCR 方法的水平。

   在综上所述,HCcAg ELISA 测定法具高度敏感性及特异性,可以明显缩短HCV 窗口期,适用于HCV 普查

 

参考文献:

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(2004-06-29 收稿)

编辑 孙孝云

 

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