乙型肝炎和丙型肝炎的实验室检查方法进展

崔红花,谢 风

(吉林大学中日联谊医院检验科,吉林长春130033)

　 随着实验室检查方法进展,对乙型肝炎和丙型肝炎的早期诊断、预防和治疗水平有很大的提高^{[1 ]} , 现就有关研究进展做一综述。

1 . 乙型肝炎的检测

乙型肝炎病毒是DNA 病毒。1965 年Blumberg在澳大利亚土著人血清中发现与乙型肝炎病毒相关的抗原,到1973 年确定为乙型肝炎表面抗原(HBVsAg) 。用HBsAg 采用的免疫沉淀法作为临床检测,开创了我国对乙型肝炎病毒抗原的检测。先后采用了琼脂免疫扩散和对流免疫电泳法来检测HBsAg、HBsAb 和HBeAg、HBeAb ,但这些检测方法的特异性及敏感性都较差。至70 年代初被一系列间接免疫凝集试验取代,包括间接血凝试验、免疫粘附血凝试验和乳胶凝集试验等,使敏感性和特异性有所提高^{[2 ]} 。为进一步提高检测的敏感性,在同期还开展了放射免疫电泳自显影法,但其操作费时(4～5 天)废物难以处理。至80 年代中期开始,以上技术逐步为EL ISA 技术取代。90 年代使用胶体金层析实验(GICA) 操作更于简便化、短时间内迅速检测到血清标志物。同期HBV DNA 检测也迅速得到发展,采用了PCR 技术和基因芯片技术检测HBV DNA ,大大提高了敏感性和特异性。

1. 1 　反向被动血凝　在临床上反向被动血凝方法检测表面抗原曾在相当一段时间占居了重要地位,直至为EL ISA 法完全取代。前者用表面抗体致敏0 型红细胞,将病人血清连续2 倍稀释与其反应一定时间后肉眼观察凝集现象判断表面抗原滴度。此法的特别之处在于可以对表面抗原做相对定量,因此颇受临床医生的欢迎,但操作复杂是其缺点。

1. 2 　酶联免疫实验( ELA) 　20世纪70 年代盛树力等开始将酶链免疫吸附实验( EL ISA) 方法介绍至国内,其发展迅速,很快覆盖了医学检验的诸多领域。双抗体夹心法是其中的代表。单克隆抗体的加入增加了检测的特异性;用辣根过氧化物酶标记链亲合素(替代卵亲合素以降低本底) 与生物素标记的一抗(单克隆抗体) 联用构成了高特异性、高敏感度的放大系统,此法灵敏度可达ng 水平^{[3 ]} 。

1. 3 　基因诊断　基因诊断是以检测感染者体内病毒核酸的有无,或含量多少来进行病原学诊断的一种方法,是从80 年代斑点杂交开始的一种分子生物学技术,90 年代以后PCR 技术迅速发展,且具有特异性好、灵敏性高、操作简便、易于自动化,因而取代了斑点杂交等临床检测技术^{[4 ,5 ]} 。实验医学中所用的PCR 包括几年前应用的巢式扩增、原位PCR、连接酶链反应和近年来发展起来的转录依赖的放大系统、连替代扩增、实时荧光PCR 定量检测技术等^{[6 ]} 。其中实时荧光定量PCR 具有省时、不易引起污染、费用相对较低等优点, 目前正在临床上广泛应用^{[7 ]} 。病毒性肝炎的基因诊断包括病毒基因的种类、含量、基因分型、亚型和变异等的诊断。虽然乙型肝炎的诊断不需要进行核酸的监测,但抗病毒治疗时,血清中的病毒核酸含量是反映病毒数量和病毒复制活跃程度最可靠的直接指标,因此病毒核酸检测显得必不可少,特别是乙肝e 抗原阴性患者,它是动态观察疗效的确切指标。随着PCR 技术的迅速发展近年来基因芯片的发展更加迅猛,基因芯片是基于计算机芯片,分子杂交,微电子和高分子化学合成相结合的综合技术。

基因芯片技术为肝炎病毒诊断提供了一种快速、敏感、高通量、高效的方法^{[6 ]} 。它可以同时对多种肝炎病毒的各亚型、变异株、耐药性等情况,通过一张芯片同时诊断出来,可为临床病毒性肝炎的诊断、用药、疗效判定及疾病的发生、发展与转归提供可靠依据。但该技术成本高,芯片的制备比较复杂、样品准备与标记较为繁琐、信号检测灵敏度也有待于进一步提高, 使该技术的普及与推广存在一定的难度^{[8 ]} 。

2 .丙型肝炎的检测

丙型肝炎病毒是单链RNA 病毒^{[9 ]} ,1989 年发现。HCV 的研究与检查已经取得了很多发展[10 ] ,我国HCV 感染试剂的研究基本与国外同步^{[2 ]} 。

2. 1 　ELISA 1989年美国Chiron 公司首次研制出诊断HCV 抗体的第一代EL ISA 诊断试剂盒用于献血员的筛选和临床检测,但假阳性问题突出,灵敏度差,不能早期诊断^{[11 ]} 。第二代抗2HCV 试剂盒用HCV 核心抗原和非结构区抗原包被微量板空,结果检测到抗2HCV 时间较第一代早16～24 日,具有一定的早期诊断价值,敏感性和特异性有了很大的提高。EL ISA 第三代则是在第二代基础上增加了NS5 抗原,此区分子量最大,而且序列较为保守,含有多个稳定的线性抗原表位,从而敏感性和特异性进一步提高。此后,有人用HCV5 (末端核心区作为抗原来源,合成一个含36 个氨基酸的多肽CP9 ,并包被在反应板上,用EL ISA 法测定血清中CP9 抗体,结果发现CP9 出现早于抗C100 ,因此前者作为早期诊断指标较后者更好。后来又在核心区CP9上有合成多肽CP10 ,用其作包被抗原进行检测,结果与抗CP9 有效的一致性,两者同时检测可明显提高HCV 感染的检出率。因其合成肽作为包被材料,所以较好地避免了重组蛋白中夹杂的SOD 多肽造成的假阳性。

2. 2 　重组免疫印迹法检测HCV抗体　Ebeling 等人将C100多肽和52121 亚基因在大肠菌中表达的抗原52121 包被在硝酸纤维素带上检测CP100 抗体,称免疫印迹试验( Recom2binant Im mune Blot As2say ,RIBA) 。因采用的抗原与CP100 基因紧密相关,所以不能克服C100EL ISA 法的缺点。第二代RIBA 在第一代的基础上增加了另外3 个重组多肽(分别来自HCV 基因组的非结构区NS4 和核心区) ,第三代则是在第二代基础上又增加了NS5 区抗原。第二代RIBA 的灵敏性和特异性明显高于第一代,而第三代在目前抗体诊断中检出率最高。现世界各地均使用RIBA22 或RIBA23 试剂,降低了HCVEL ISA 诊断试剂在检测低危人群中所产生的假阳性结果,但RIBA 操作复杂。近几年新建立的斑点免疫渗滤试验(DIFA) 和斑点免疫层析实验(DICA) 操作异常简便而又不失稳定性、特异性和灵敏性,具有巨大的推广价值。

2. 3 　固相酶免实验检测抗体　Toniutto 等人还报导用固相酶免实验检测丙肝的核心抗体IgM ,本法在HCV 感染的静脉药瘾者,尤其是感染HCVIa 型者中有较高的检出率。

2. 4 　EIA 检测丙肝核心抗原　标本仅需30 min 用3 种不同洗涤成分的液体一次性预处理,不需要特殊的仪器。在感染的初期抗2HCV 尚未出现时即可检测出HCVAg ,可用于HCV 感染的早期诊断,比基因技术检测HCV RNA 简单,同时敏感性好、特异

性高。

2. 5 　基因诊断　主要有RT2PCR、核酸分子杂交和免疫2PCR^{[12 ,13 ]} 。国外已普遍开展HCV 基因扩增方法,直接检测HCV2RNA ,确定体内有病原体存在,且反映其复制情况, 以达到早期特异有效确诊^{[13 ]} 。用PCR 检测HCV RNA 灵敏度高,可检测出低于黑猩猩最小感染剂量(CID/ ml) 1/ 10 的HCVRNA。任何黑猩猩感染HCV 后1～2 周,血清中即可检测到HCV RNA。因此,PCR 可用于早期诊断。HCV RNA 阳性说明HCV 仍在复制,所以它有助于鉴别活动性HCV 感染或既往感染。PCR 法检测HCV RNA 的局限性在于检测技术过程复杂,需要特殊的仪器、耗时及价格昂贵而不宜推广。

参考文献:

[ 1 ]Labiratory. Diagrosis of vinel hepatitis Bcand C Acta Med Lvoatica.2005 ,59 (5) :405.

[2 ]陶其敏,魏　来. 我国病毒性肝炎病原学诊断的发展和展望[J ] .中华检验医学杂志,2003 ,26 :723.

[3 ]王　健,闵福援. 乙肝病毒血清标志物的检测方法及临床意义[J ] . 中华检验医学杂志,2005 ,28 :113.

[4 ] Fagan EA ,Guarnerp , Pera SD ,et al. Quantition of hepatitis B virusDNA (HBV) in serum using the spot . Hybridization technique andscintiuation counting[J ] . Jvirolm othods ,1986 ,12 (3 - 4) :251.

[ 5 ]Scaglioni pier Paolo ,Melegari Margherita ,Wands Jack R1Recent ad2vances in the molecular biology of hepatitis B virus.Bailliere ,s Clini2cal Gastroenterlogy ,1996 ,10 (2) :207.

[ 6 ]Lisby G. Application of nucleic acid amplification in clinical microbi2ology[J ] . Mol Biothechnol ,1999 ,12 :75.

[7 ]Weiss J ,Wu J ,Fsrrenkopf B ,et al. Real time Taq Man PCR detec2tion and quantitation of HBV genotype A2G with the use of an inter2nal quantition standard [ J ] . Journal of Clinical Virology , 2004 , 30 ,(1) :86.

[8 ]刘彦华,全文斌,吴小意,等. 生物芯片技术及其应用前景[J ] . 中华检验医学杂志,2000 ,23 (3) :177.

[ 9 ]Simmonds P. Virology of hepatitis C virus[J ] . Clinical Therapeutics ,1996 ,18. (Supplement2) :9.

[ 10 ] Erensoy Selda. Diagnosis of hepatitis C virus ( ucv) infection andlaboratory monitoring of its therapy. Journal of clinical virology ,2001 ,21 (3) :271.

[ 11 ] Scbreber GB ,Bush MP , Kleinman SH ,et al. The risk of transfu2sion2transmitted viral infections epidemiology donor study [ J ] . NEng J Med ,1996 ,334 (26) :1685.

[ 12 ] Tang. Yi2wei ,Li. haijing ;Roberto. Ann et al. Detectyion of hepatitisC virus by a user2develoed reverse tuanscriptase2PCR and use ofamptification productus for subsequent genotyping ,Journal of clini2cal virology ,2004 ,31 (2) :148.

[ 13 ]Cony2Cantilena ,Cathy. Hepatitis C virus diagnosis :tcchnology ,clin2ical applications and impacts[J ] . Trends in Biotechnology ,1997 ,15(2) :71.

[14 ]Roth wk ,Weber M ,Serfried E. Feasibitity and efficacy of routinePCR screening of blood clonations for hepatitis c virus , hepatitisBvirus ,and HIV21 in a blood2band setting [ J ] . Lancet , 1999 , 353(9150) :359.